Flëssegchromatographie ass d'Haaptmethod fir den Inhalt vun all Komponent an Gëftstoffer a Rohmaterial, Zwëscheprodukter, Preparatiounen a Verpackungsmaterial ze testen, awer vill Substanzen hu keng Standardmethoden fir op ze vertrauen, also ass et inévitabel nei Methoden z'entwéckelen. An der Entwécklung vu Flëssegkeetsphase Methoden ass d'chromatografesch Kolonn de Kär vun der Flëssegchromatographie, also ass et entscheedend wéi eng gëeegent chromatografesch Kolonn ze wielen. An dësem Artikel wäert den Auteur erkläre wéi een eng Flëssegchromatographie Kolonn aus dräi Aspekter auswielt: allgemeng Iddien, Iwwerleeungen an Uwendungsomfang.
A.Allgemeng Iddien fir d'Auswiel vu Flëssegchromatographiesäulen
1. Evaluéiert déi physesch a chemesch Eegeschafte vum Analyt: wéi chemesch Struktur, Solubilitéit, Stabilitéit (wéi ob et einfach ass ze oxidéiert / reduzéiert / hydrolyséiert), Aciditéit an Alkalinitéit, etc., besonnesch déi chemesch Struktur ass de Schlëssel Faktor bei der Bestëmmung vun den Eegeschaften, sou wéi d'konjugéiert Grupp huet staark ultraviolet Absorptioun a staark Fluoreszenz;
2. Bestëmmt den Zweck vun der Analyse: ob héich Trennung, héich Spalteffizienz, kuerz Analysezäit, héich Sensibilitéit, Héichdrockresistenz, laang Kolonnliewen, niddreg Käschten, etc.
- Wielt eng gëeegent chromatografesch Kolonn: Verstinn d'Zesummesetzung, physesch a chemesch Eegeschafte vum chromatografesche Filler, sou wéi d'Partikelgréisst, d'Poregréisst, d'Temperaturtoleranz, d'PH Toleranz, d'Adsorptioun vum Analyt, asw.
- Considératiounen fir d'Auswiel vun Flëssegchromatographie Kolonnen
Dëst Kapitel wäert d'Faktoren diskutéieren, déi berücksichtegt ginn wann Dir eng Chromatographiekolonn aus der Perspektiv vun de physikaleschen a chemeschen Eegeschafte vun der Chromatographiekolonn selwer auswielt. 2.1 Filler Matrixentgasung
2.1.1 Silikagel Matrix D'Füllmatrix vun de meeschte Flëssegchromatographiesäulen ass Silikagel. Dës Zort Filler huet héich Rengheet, niddreg Käschten, héich mechanesch Kraaft, an ass einfach ze modifizéieren Gruppen (wéi Phenyl Bindung, Amino Bindung, Cyano Bindung, etc.), awer de pH-Wäert an d'Temperaturbereich, déi et toleréiert ass limitéiert: pH-Gamme vun de meeschte Silikagel Matrixfiller ass 2 bis 8, awer de pH-Gamme vu speziell modifizéierten Silikagel gebonnen Phasen kann esou breet wéi 1,5 bis 10 sinn, an et ginn och speziell modifizéiert Silikagel gebonnen Phasen déi stabil sinn bei niddregen pH, wéi Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, déi bei pH 1 bis 8 stabil ass; déi iewescht Temperaturlimit vun der Silikagel Matrix ass normalerweis 60 ℃, a verschidde Chromatographiesäulen kënnen eng Temperatur vu 40 ℃ bei héijen pH toleréieren.
2.1.2 Polymer Matrix Polymer Filler si meeschtens Polystyrol-Divinylbenzen oder Polymethacrylat. Hir Virdeeler sinn datt se e breet pH-Bereich toleréiere kënnen - si kënnen am Beräich vun 1 bis 14 benotzt ginn, a si si méi resistent géint héich Temperaturen (kann iwwer 80 ° C erreechen). Am Verglach mat Silica-baséiert C18 Filler, huet dës Zort Filler méi staark Hydrophobitéit, an de makroporöse Polymer ass ganz effektiv fir Proben wéi Proteinen ze trennen. Seng Nodeeler sinn datt d'Kolonneffizienz méi niddereg ass an d'mechanesch Kraaft méi schwaach ass wéi déi vu Silica-baséiert Filler. 2.2 Partikelform
Déi meescht modern HPLC Filler si kugelfërmeg Partikelen, awer heiansdo si se onregelméisseg Partikelen. Kugelgestalt Partikele kënne méi nidderegen Kolonnendrock, méi héije Kolonneffizienz, Stabilitéit a méi laang Liewensdauer ubidden; wann Dir héichviskositéit mobil Phasen benotzt (wéi Phosphorsäure) oder wann d'Proufléisung viskos ass, hunn onregelméisseg Partikelen eng méi grouss spezifesch Uewerfläch, déi méi hëllefräich ass fir déi voll Handlung vun den zwou Phasen, an de Präis ass relativ niddereg. 2.3 Partikelgréisst
Wat méi kleng d'Partikelgréisst ass, wat méi héich d'Kolonneffizienz an dest méi héich ass d'Trennung, awer dest méi schlecht ass d'Héichdrockresistenz. Déi meescht benotzt Kolonn ass d'5 μm Partikelgréisst Kolonn; Wann d'Trennungsfuerderung héich ass, kann e 1,5-3 μm Filler ausgewielt ginn, wat hëllefe fir d'Trennungsproblem vun e puer komplexe Matrix- a Multi-Komponente-Proben ze léisen. UPLC kann 1,5 μm Filler benotzen; 10 μm oder méi grouss Partikelgréisst Filler ginn dacks fir semi-préparativ oder präparativ Sailen benotzt. 2.4 Kuelestoffgehalt
Kuelestoffgehalt bezitt sech op den Undeel vun der gebonnener Phase op der Uewerfläch vum Silikagel, wat mat enger spezifescher Uewerfläch an der gebonnener Phasebedeckung verbonnen ass. Héich Kuelestoff Inhalt stellt héich Kolonn Kapazitéit an héich Opléisung, a gëtt dacks fir komplex Echantillon benotzt héich Trennung verlaangen, mä wéinst der laanger Interaktioun Zäit tëscht den zwou Phasen, ass d'Analyse Zäit laang; niddereg Kuelestoff Inhalt chromatographic Saile hunn eng méi kuerz Analyse Zäit a kann verschidden selectivities weisen, a sinn oft fir einfach Echantillon benotzt dass rapid Analyse verlaangen an Echantillon dass héich wässerlech Phase Konditiounen verlaangen. Allgemeng läit de Kuelestoffgehalt vu C18 vu 7% bis 19%. 2.5 Pore Gréisst a spezifesch Uewerfläch
HPLC Adsorptiounsmedien si poröse Partikelen, an déi meescht Interaktioune fënnt an de Pore statt. Dofir musse Moleküle an d'Poren kommen fir adsorbéiert a getrennt ze ginn.
Pore Gréisst a spezifesch Uewerfläch sinn zwee komplementär Konzepter. Kleng Pore Gréisst bedeit grouss spezifesch Uewerfläch, a vice versa. Eng grouss spezifesch Uewerfläch kann d'Interaktioun tëscht Probemoleküle a gebonnen Phasen erhéijen, d'Retentioun verbesseren, d'Probebelaaschtung a Kolonnkapazitéit erhéijen, an d'Trennung vu komplexe Komponenten. Voll poröse Filler gehéieren zu dëser Aart vu Filler. Fir déi mat héije Trennungsfuerderunge gëtt et recommandéiert Filler mat grousser spezifescher Uewerfläch ze wielen; kleng spezifesch Uewerfläch kann zréck Drock reduzéieren, Kolonn Effizienz verbesseren, an Gläichgewiicht Zäit reduzéieren, déi fir Gradient Analyse gëeegent ass. Core-Shell Filler gehéieren zu dëser Aart vu Filler. Op der Viraussetzung fir d'Trennung ze garantéieren, ass et recommandéiert Filler mat enger klenger spezifescher Uewerfläch ze wielen fir déi mat héijer Analyseeffizienzfuerderunge. 2.6 Pore Volume a mechanesch Kraaft
Pore Volume, och bekannt als "Pore Volume", bezitt sech op d'Gréisst vum Void Volume pro Eenheet Partikel. Et kann d'mechanesch Kraaft vum Filler gutt reflektéieren. Déi mechanesch Kraaft vu Filler mat grousse Porevolumen ass liicht méi schwaach wéi déi vu Filler mat klenge Porevolumen. Filler mat Porevolumen manner wéi oder gläich wéi 1.5 mL / g gi meeschtens fir HPLC Trennung benotzt, wärend Filler mat Pore Volume méi wéi 1.5 mL / g haaptsächlech fir molekulare Ausgrenzungschromatographie a Low-Pressure Chromatography benotzt ginn. 2.7 Capping Taux
D'Capping kann d'Tailing Peaks reduzéieren, déi duerch d'Interaktioun tëscht Verbindungen a exponéierte Silanolgruppen verursaacht ginn (wéi ionesch Bindung tëscht alkalesche Verbindungen a Silanolgruppen, Van der Waals Kräften a Waasserstoffbindungen tëscht sauerem Verbindungen a Silanolgruppen), doduerch d'Kolonneffizienz an d'Spëtzform verbesseren . Uncapped gebonnen Phasen produzéiere verschidde Selektivitéiten relativ zu capped gebonnen Phasen, besonnesch fir polare Echantillon.
- Uwendungsomfang vu verschiddene Flëssegchromatographiesäulen
Dëst Kapitel wäert den Uwendungsomfang vu verschiddenen Aarte vu Flëssegchromatographiesäulen duerch e puer Fäll beschreiwen.
3.1 Ëmgedréit-Phase C18 chromatographic Kolonn
D'C18 Kolonn ass déi meescht benotzt ëmgedréint-Phase Kolonn, déi den Inhalt an Gëftstoffer Tester vun meescht organesch Substanzen treffen kann, an ass applicabel op mëttel-polare, schwaach polar an net-polare Substanzen. Den Typ an d'Spezifikatioun vun der C18 chromatographescher Kolonn soll no de spezifesche Trennungsfuerderunge ausgewielt ginn. Zum Beispill, fir Substanzen mat héich Trennung Ufuerderunge, 5 μm * 4,6 mm * 250 mm Spezifikatioune sinn oft benotzt; fir Substanzen mat komplexen Trennungsmatrixen an ähnlecher Polaritéit kënnen 4 μm * 4,6 mm * 250 mm Spezifikatioune oder méi kleng Partikelgréissten benotzt ginn. Zum Beispill huet den Auteur eng 3 μm * 4.6 mm * 250 mm Kolonn benotzt fir zwee genotoxesch Gëftstoffer am Celecoxib API z'entdecken. D'Trennung vun deenen zwee Substanzen kann 2,9 erreechen, wat excellent ass. Zousätzlech, ënner der Viraussetzung fir d'Trennung ze garantéieren, wann eng séier Analyse erfuerderlech ass, gëtt dacks eng kuerz Kolonn vun 10 mm oder 15 mm ausgewielt. Zum Beispill, wann den Auteur LC-MS /MS benotzt fir eng genotoxesch Gëftegkeet am Piperaquinphosphat API z'entdecken, gouf eng 3 μm * 2,1 mm * 100 mm Kolonn benotzt. D'Trennung tëscht der Gëftstoffer an der Haaptkomponent war 2,0, an d'Detektioun vun enger Probe kann a 5 Minutten ofgeschloss ginn. 3.2 Ëmgedréint-Phase Phenyl Kolonn
Phenyl Kolonn ass och eng Zort vun ëmgedréint Phase Kolonn. Dës Zort Kolonn huet eng staark Selektivitéit fir aromatesch Verbindungen. Wann d'Äntwert vun aromatesche Verbindunge gemooss vun der gewéinlecher C18 Kolonn schwaach ass, kënnt Dir betruechten d'Phenyl Kolonn ze ersetzen. Zum Beispill, wann ech celecoxib API gemaach hunn, war d'Haaptkomponentreaktioun gemooss vun der Phenylkolonne vum selwechte Fabrikant an déiselwecht Spezifizéierung (all 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) ongeféier 7 Mol déi vun der C18 Kolonn. 3.3 Normal-Phas Kolonn
Als effektiv Zousaz zu ëmgedréint-Phase Kolonn, ass normal-Phas Kolonn gëeegent fir héich polare Verbindungen. Wann de Peak nach ëmmer ganz séier ass wann Dir mat méi wéi 90% wässerlecher Phase an der ëmgedréint-Phase Kolonn eluéiert, a souguer no an iwwerlappt mat der Léisungsmëttel Peak, kënnt Dir berécksiichtegen d'Normalphase Kolonn ze ersetzen. Dës Zort Kolonn enthält hilic Kolonn, Amino Kolonn, Cyano Kolonn, etc.
3.3.1 Hilesch Kolonn Hilesch Kolonn baut normalerweis hydrophile Gruppen an der gebonnener Alkylkette an, fir d'Äntwert op polare Substanzen ze verbesseren. Dës Zort Kolonn ass gëeegent fir d'Analyse vun Zocker Substanzen. Den Auteur huet dës Zort Kolonn benotzt wann Dir den Inhalt a verbonne Substanzen vu Xylose a seng Derivate mécht. D'Isomere vun engem Xylose-Derivat kënnen och gutt getrennt sinn;
3.3.2 Amino Kolonn a Cyano Kolonn Amino Kolonn an Cyano Kolonn bezéie sech op d'Aféierung vun Amino- a Cyano-Modifikatiounen um Enn vun der gebonnener Alkylkette, respektiv, fir d'Selektivitéit fir speziell Substanzen ze verbesseren: zum Beispill, Aminokolonne ass eng gutt Wiel fir d'Trennung vun Zucker, Aminosäuren, Basen an Amiden; Cyano Kolonn huet besser Selektivitéit wann se hydréiert an onhydrogenéiert strukturell ähnlech Substanzen trennen wéinst der Präsenz vu konjugéierte Bindungen. Amino Kolonn an Cyano Kolonn kann dacks tëscht normal Phase Kolonn an ëmgedréint Phase Kolonn geschalt ginn, awer heefeg Wiessel ass net recommandéiert. 3.4 Chiral Kolonn
Chiral Kolonn, wéi den Numm et scho seet, ass gëeegent fir d'Trennung an d'Analyse vu chirale Verbindungen, besonnesch am Beräich vun de Medikamenter. Dës Aart vu Kolonn kann berécksiichtegt ginn wann konventionell ëmgedréint Phase an normal Phase Säulen d'Trennung vun Isomeren net erreechen kënnen. Zum Beispill huet den Auteur eng 5 μm * 4.6 mm * 250 mm chiral Kolonn benotzt fir déi zwee Isomere vun 1,2-Diphenylethylendiamin ze trennen: (1S, 2S)-1, 2-Diphenylethylendiamin an (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine, an d'Trennung tëscht deenen zwee erreecht ongeféier 2,0. Wéi och ëmmer, chiral Säulen si méi deier wéi aner Aarte vu Säulen, normalerweis 1W + / Stéck. Wann et e Besoin fir sou Sailen ass, muss d'Eenheet e genuch Budget maachen. 3.5 Ionenaustausch Kolonn
Ionenaustauschkolonnen si gëeegent fir d'Trennung an d'Analyse vu geluedenen Ionen, wéi Ionen, Proteinen, Nukleinsäuren an e puer Zockerstoffer. Geméiss dem Fillertyp gi se a Kationaustauschsäulen opgedeelt, Anionenaustauschsäulen, a staark Kationaustauschkolonnen.
Kationaustauschkolonnen enthalen Kalziumbaséiert a Waasserstoffbaséiert Kolonnen, déi haaptsächlech fir d'Analyse vu kationesche Substanzen wéi Aminosäuren gëeegent sinn. Zum Beispill huet den Auteur Kalzium-baséiert Kolonnen benotzt wann Dir Kalziumgluconat a Kalziumacetat an enger Spullléisung analyséiert. Béid Substanzen hu staark Äntwerte bei λ = 210nm, an d'Trennungsgrad erreecht 3.0; den Auteur huet Waasserstoff-baséiert Sailen benotzt wann Dir Glukose-Zesummenhang Substanzen analyséiert. Verschidde gréisser verwandte Substanzen - Maltose, Maltotriose a Fruktose - haten eng héich Sensibilitéit ënner Differentialdetektoren, mat enger Detektiounsgrenz esou niddereg wéi 0,5 ppm an engem Trennungsgrad vun 2,0-2,5.
Anionaustauschsäulen sinn haaptsächlech gëeegent fir d'Analyse vun anionesche Substanzen wéi organesch Säuren an Halogenionen; staark Kationaustauschkolonnen hunn méi héich Ionenaustauschkapazitéit a Selektivitéit, a si passend fir d'Trennung an d'Analyse vu komplexe Proben.
Dat hei uewen ass just eng Aféierung an d'Typen an d'Applikatiounsbereich vu verschiddene gemeinsame Flëssegchromatographiesäulen kombinéiert mat der eegener Erfahrung vum Auteur. Et ginn aner speziell Aarte vu chromatographesche Sailen an aktuellen Uwendungen, sou wéi grouss-pore chromatographesch Sailen, kleng-pore chromatographic Saile, Affinitéit chromatography Saile, multimode chromatographic Saile, ultra-héich Leeschtung Flëssegket chromatography Saile (UHPLC), superkritesch Flëssegket chromatography Kolonnen ( SFC), etc. Si spillen eng wichteg Roll a verschiddene Beräicher. Déi spezifesch Aart vun der chromatographescher Kolonn soll ausgewielt ginn no der Struktur an Eegeschafte vun der Probe, Trennungsfuerderunge an aner Zwecker.
Post Zäit: Jun-14-2024